Gliiarakkude hulka kuuluvad astrotsüüdid on üheks peamiseks rakutüübiks kesknärvisüsteemis (KNS). Astrotsüütidel on oluline roll KNSi arengu ja homöostaasi tagamisel ning nende rakkude talitlushäired aitavad kaasa kõigi peamiste neuroloogiliste häirete tekkimisele. Hiljutised uuringud on näidanud, et neuronite aktiveerumise mõjul neist lähtuvad stiimulid avaldavad olulist mõju astrotsüütides toimuvale geeniekspressioonile. Neid muutusi reguleerivad mehhanismid astrotsüütides on aga veel suures osas teadmata. Käesolev projekt keskendub just selle küsimuse uurimisele. Me kasutame nüüdisaegseid funktsionaalgenoomika lähenemisviise, et analüüsida regulatoorelemente ja transkriptsioonifaktoreid astrotsüütides vastusena neuronite aktivatsioonile. Projekti tulemusel saadav ülevaade nendest mehhanismidest aitab aru saada stiimul-sõltuvast geeniekspressiooni regulatsioonist KNSis. See omakorda panustab mitmete neuropatoloogiate tekkemehhanismide mõistmisesse.
Käesoleva projekti eesmärgiks oli uurida, kuidas reguleeritakse neuronites stiimul-sõltuvaid enhansereid enhanser-RNA-de (eRNA-de) kaudu, arvestades seejuures eRNA-de ebastabiilse ja ajutise olemuse tekitatud väljakutseid. Kasutasime edasijõudnud järgmise põlvkonna sekveneerimist (NGS) koos molekulaarbioloogia meetoditega, et mõista eRNA funktsiooni stiimul-sõltuvas geeniekspressioonis. Projekti kriitiliseks ülesandeks oli välja töötada usaldusväärne kogu genoomi hõlmav meetod eRNA 5’ ja 3’ otste täpseks määratlemiseks. Optimeerisime MAPcap meetodi, millest sai eelistatud lähenemine transkriptsiooni alguspunktide (TSS) määramiseks tänu madalale sekveneerimis sügavusele, varasemate RNA proovide ühilduvusele ja lihtsale integreerimisele töövoogu. Mudelsüsteemideks valisime roti primaarsete kortikaalsete neuronite ja Neuro2A hiire neuroblastoomi kultuurid. Mõlema süsteemi puhul testisime ja optimeerisime kasvatamise, töötlemise ja subtsellulaarse fraktsioneerimise protokolle. Samuti arendasime RT-qPCR analüüse nii eRNA-de kui ka varajaste geenide valideerimiseks. eRNA-de funktsionaalseks valideerimiseks töötasime välja tervikliku protseduuri, mis hõlmab in vitro transkriptsiooni, biokeemilisi pull-down analüüse ja massispektromeetriat. Seda töövoogu rakendame pärast NGS andmestike analüüsimist ja huvipakkuvate eRNA-de määratlemist. Kokkuvõttes on see projekt edukalt loonud meetodeid ja genereerinud andmeid, mis aitavad meil paremini mõista eRNA-de rolli neuronite geeniregulatsioonis. Selle uurimistöö tulemused loovad aluse olulistele avastustele neurobioloogias ja pakuvad tugeva platvormi tulevasteks uuringuteks. Rahastuse roll kirjeldatud tulemuste saavutamisel on olnud otsustava tähtsusega, andes seejuures märkimisväärseid panuseid teadusvaldkonda.
Pitt-Hopkinsi sündroom (PTHS) on geneetiline autismi spektri häire, mida põhjustavad mutatsioonid või deletsioonid transkriptsioonifaktori 4 (TCF4) geeni ühes alleelis. PTHS loommudelis on näidatud, et TCF4 funktsioonide sünnijärgne taastamine aitab haigussümptomeid leevendada. Seega võivad terapeutilised lähenemisviisid TCF4 taseme või aktiivsuse suurendamiseks aidata ka Pitt-Hopkinsi sündroomiga patsiente. Varasemalt on teada, et histooni deatsetülaaside aktiivsuse pärssimine suurendab TCF4 transkriptsiooni aktiivsust ja parandab hiiremudelis TCF4 puudumisega seotud mäluhäireid. Seda mõju vahendavad tõenäoliselt mõningad TCF4 kaasrepressorid, näiteks ETO / RUNX1T1, kes värbavad histooni deatsetülaase. Histooni deatsetülaaside inhibiitoritel on aga väga laialdane mõju raku transkriptsioonile ja need omavad seetõttu erinevaid kõrvalmõjusid. Käesolevas projektis pakume välja, et spetsiifiliste TCF4 kaasaktivaatorite või kaasrepressorite aktiivsuse või TCF4-ga seondumise mõjutamine võib suurendada TCF4-sõltuvat transkriptsiooni, leevendades seega Pitt-Hopkinsi sündroomi sümptomeid, omades samal ajal patsientidele vähem kõrvaltoimeid. Sel eesmärgil püüame põhjalikult tuvastada TCF4-st sõltuvas transkriptsioonis osalevad kaasregulaatorid ja leida viise nende tegevuse mõjutamiseks. Projekti konkreetsed eesmärgid on järgmised: (1) tuvastada erinevate TCF4 valgu variantidega seotud kaasregulaatorid; (2) määrata tuvastatud kaasregulaatorite toimemehhanism ja TCF4 valguga interakteeruvad piirkonnad; (3) töötada välja vahendid TCF4 kaasregulaatorite transkriptsioonilise aktiivsuse või seondumise mõjutamiseks.