Projektid

Neuronaalne plastilisus, närvisüsteemi võime kohaneda sisemiste või väliste stiimulitega, on põhiline omadus, mis on aju arengu, õppimise, mälu ja neurodegeneratiivsete häirete taluvuse aluseks. Molekulaarsel tasandil sõltub neuronaalne plastilisus neuronaalse aktiivsuse reguleeritud geenide (nARG) aktiveerimisest, mis on tihedalt kontrollitud enhancer piirkondade - lühikeste regulatiivsete DNA järjestuste - poolt. Hiljutised leiud näitavad, et aktiivsed enhanserid toodavad enhanser-derived RNA-d (eRNA-d), mis võivad mängida olulist rolli geenide reguleerimisel keeruliste vastastikmõjude kaudu DNA, RNA ja valkudega. Hoolimata nende võimalikust tähtsusest on eRNAde funktsioon neuronaalses aktiivsuses endiselt halvasti mõistetav nende ajutise olemuse ja nende uurimisega seotud tehniliste probleemide tõttu. Selle projekti eesmärk on töötada välja uuenduslikud eksperimentaalsed lähenemisviisid, et selgitada eRNAde rolli nARG-i aktiveerimisel. Kasutades näriliste primaarset neuronaalset rakukultuuri - mis on hästi tuntud mudel neuronaalse plastilisuse uurimiseks - analüüsitakse projektis süstemaatiliselt eRNA vastuseid välistele stiimulitele suure ajalise eraldusvõimega. eRNAde molekulaarsete omaduste iseloomustamiseks kombineeritakse põhjalikke sekveneerimistehnoloogiaid. Neid andmeid täiendatakse epigenoomilise profileerimisega, et korreleerida enhanserite aktiivsust transkriptsiooni dünaamikaga. eRNAde molekulaarsete omaduste iseloomustamiseks kombineeritakse uudsemat sekveneerimistehnoloogiaid. Neid andmeid täiendatakse epigenoomilise profileerimisega, et korreleerida võimendaja aktiivsust transkriptsiooni dünaamikaga. Projektis uuritakse ka võimalikke seoseid eRNA omaduste ja neurodegeneratiivsete haigustega seotud mutatsioonide vahel, andes ülevaate sellest, kuidas lühiajaline stimulatsiooniga seotud geenide aktiveerimine võib aidata kaasa haiguse fenotüüpidele. Koos loovad need uuringud raamistiku eRNAde regulatiivse rolli mõistmiseks neuronaalses plastilisuses ja nende laiema mõju mõistmiseks aju arengule ja häiretele.

Enhanserid on lühikesed distaalsed cis-reguleerivad DNA-piirkonnad, mis juhivad geeni ekspressiooni. Siiski ei toimi enhanserid ainult DNA-üksustena. Aktiveeritud enhanserid transkribeeritakse RNA-polümeraas II (RNAPII) poolt, mis toodab enhanser-derived RNAsid (eRNAd). eRNAde tootmine loob täiendavaid transregulatsioonimehhanisme, mida hõlbustavad DNA-RNA, RNA-RNA või valgu-RNA vastastikmõjud. eRNAde kiire lagunemise kiiruse ning töökindlate ja standardiseeritud sekveneerimismeetodite puudumise tõttu on aruanded eRNA molekulide molekulaarse olemuse ja nende töötlemise kohta vastuolulised, mistõttu on eRNAde poolt toimuva geenireguleerimise mehhanismid vastuolulised. Veelgi vähem on teada eRNA ko- ja posttranskriptsioonilise töötlemise kohta. Selle projekti eesmärk on ületada vastuolud ja täita teadmislünk, uurides hästi määratletud eksperimentaalset süsteemi, kultiveeritud roti kortikaalseid neuroneid ja vahetu varajase geeni (IEG) vastuse aktiveerimist, häirides eRNA põhilist endonukleaasi ja kombineerides seda eRNA-le kohandatud sekveneerimis-, arvutuslikke ja biokeemilisi meetodeid. Välja töötatud integreeriv lähenemisviis paljastab eRNA molekulide ja nende eellaste molekulaarsed omadused kogu genoomi ulatuses, avades võimaluse uurida eRNA biogeneesi, et paremini mõista eRNA-vahendatud geeniregulatsiooni taga olevaid molekulaarseid mehhanisme.

Käesoleva projekti eesmärgiks oli uurida, kuidas reguleeritakse neuronites stiimul-sõltuvaid enhansereid enhanser-RNA-de (eRNA-de) kaudu, arvestades seejuures eRNA-de ebastabiilse ja ajutise olemuse tekitatud väljakutseid. Kasutasime edasijõudnud järgmise põlvkonna sekveneerimist (NGS) koos molekulaarbioloogia meetoditega, et mõista eRNA funktsiooni stiimul-sõltuvas geeniekspressioonis. Projekti kriitiliseks ülesandeks oli välja töötada usaldusväärne kogu genoomi hõlmav meetod eRNA 5’ ja 3’ otste täpseks määratlemiseks. Optimeerisime MAPcap meetodi, millest sai eelistatud lähenemine transkriptsiooni alguspunktide (TSS) määramiseks tänu madalale sekveneerimis sügavusele, varasemate RNA proovide ühilduvusele ja lihtsale integreerimisele töövoogu. Mudelsüsteemideks valisime roti primaarsete kortikaalsete neuronite ja Neuro2A hiire neuroblastoomi kultuurid. Mõlema süsteemi puhul testisime ja optimeerisime kasvatamise, töötlemise ja subtsellulaarse fraktsioneerimise protokolle. Samuti arendasime RT-qPCR analüüse nii eRNA-de kui ka varajaste geenide valideerimiseks. eRNA-de funktsionaalseks valideerimiseks töötasime välja tervikliku protseduuri, mis hõlmab in vitro transkriptsiooni, biokeemilisi pull-down analüüse ja massispektromeetriat. Seda töövoogu rakendame pärast NGS andmestike analüüsimist ja huvipakkuvate eRNA-de määratlemist. Kokkuvõttes on see projekt edukalt loonud meetodeid ja genereerinud andmeid, mis aitavad meil paremini mõista eRNA-de rolli neuronite geeniregulatsioonis. Selle uurimistöö tulemused loovad aluse olulistele avastustele neurobioloogias ja pakuvad tugeva platvormi tulevasteks uuringuteks. Rahastuse roll kirjeldatud tulemuste saavutamisel on olnud otsustava tähtsusega, andes seejuures märkimisväärseid panuseid teadusvaldkonda.

Pitt-Hopkinsi sündroom (PTHS) on geneetiline autismi spektri häire, mida põhjustavad mutatsioonid või deletsioonid transkriptsioonifaktori 4 (TCF4) geeni ühes alleelis. PTHS loommudelis on näidatud, et TCF4 funktsioonide sünnijärgne taastamine aitab haigussümptomeid leevendada. Seega võivad terapeutilised lähenemisviisid TCF4 taseme või aktiivsuse suurendamiseks aidata ka Pitt-Hopkinsi sündroomiga patsiente. Varasemalt on teada, et histooni deatsetülaaside aktiivsuse pärssimine suurendab TCF4 transkriptsiooni aktiivsust ja parandab hiiremudelis TCF4 puudumisega seotud mäluhäireid. Seda mõju vahendavad tõenäoliselt mõningad TCF4 kaasrepressorid, näiteks ETO / RUNX1T1, kes värbavad histooni deatsetülaase. Histooni deatsetülaaside inhibiitoritel on aga väga laialdane mõju raku transkriptsioonile ja need omavad seetõttu erinevaid kõrvalmõjusid. Käesolevas projektis pakume välja, et spetsiifiliste TCF4 kaasaktivaatorite või kaasrepressorite aktiivsuse või TCF4-ga seondumise mõjutamine võib suurendada TCF4-sõltuvat transkriptsiooni, leevendades seega Pitt-Hopkinsi sündroomi sümptomeid, omades samal ajal patsientidele vähem kõrvaltoimeid. Sel eesmärgil püüame põhjalikult tuvastada TCF4-st sõltuvas transkriptsioonis osalevad kaasregulaatorid ja leida viise nende tegevuse mõjutamiseks. Projekti konkreetsed eesmärgid on järgmised: (1) tuvastada erinevate TCF4 valgu variantidega seotud kaasregulaatorid; (2) määrata tuvastatud kaasregulaatorite toimemehhanism ja TCF4 valguga interakteeruvad piirkonnad; (3) töötada välja vahendid TCF4 kaasregulaatorite transkriptsioonilise aktiivsuse või seondumise mõjutamiseks.

Uute sünapsite moodustamine ja eksisteerivate sünapsite tugevuse ja stabiilsuse muutmine on mälu ja pikaajaliste käitumuslike kohastumiste peamiseks rakuliseks aluseks. Neuraalse signaliseerimise poolt arenguga reguleeritud geeniekspressioon mängib olulist rolli sünapsite arengus ja toimimises ja selle regulatsiooni häired põhjustavad paljusid närvisüsteemi haiguseid. Neuraalsest aktiivsusest sõltuva geeniekspressiooni regulatsioonimehhanismide väljaselgitamine on oluline nii närvisüsteemi funktsioneerimise mõistmiseks kui ka uute märklaudade leidmiseks ravimiarenduses. Käesoleva projekti eesmärgiks on iseloomustada neuraalse aktiivsusega reguleeritud geenide avaldumise, k.a. transkriptsiooni, translatsiooni ja posttranslatsioonilise modifitseerimiste, molekulaarseid aluseid närvisüsteemis ja selle patoloogiates. Projekt keskendub kahele geenile, neurotrofiinile BDNF ja aluselisele heeliks-ling-heeliks transkriptsioonitegurile TCF4.

Tippkeskuse eesmärgiks on genoomika ja teiste "oomika" tehnoloogiate arengust tulenevate alusteaduse saavutuste kiiremat rakendamist haiguste molekulaarsete ja evolutsiooniliste mehhanismide väljaselgitamiseks, ennetamiseks, diagnostikaks ja raviks. Tippkeskus koondab 12 uurimisrühma, keskuse partnerid on Tartu Ülikool, Eesti biokeskus ja Tallinna Tehnikaülikool.

Projektis uuriti, kuidas aju päritolu neurotroofset tegurit (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), mida tavaliselt uuritakse neuronites, reguleeritakse südamerakkudes ja mitteneuronaalsetes ajurakkudes, mida nimetatakse astrotsüütideks. Leidsime signaalid, mis "lülitavad" BDNF-i südamerakkudes sisse, näiteks noradrenaliin (sarnane adrenaliinile), ja uurisime DNA piirkondi, mis aitavad seda lülitit kontrollida. Seejärel keskendusime astrotsüütidele, mis on teatud tüüpi neuroneid toetavad mitteneuronaalsed rakud (üks tüüp nn gliiarakke). Me täheldasime, et kui neuroneid ja astrotsüüte hoitakse koos ja neuroneid aktiveeritakse, reageerivad astrotsüüdid, tootes rohkem BDNF-i. BDNF on aktiivselt uuritud valk, kuna tal on olulised funktsioonid kesknärvisüsteemis ja eriti neuronites. Viimasel ajal on BDNF-i ekspressiooni ja funktsiooni uuritud ka teistes rakutüüpides, mis näitab selle neurotrofiini rollide olemasolu väljaspool neuroneid. Samuti muudab BDNF düsregulatsioon mitmetes patoloogilistes seisundites selle huvitavaks sihtmärgiks terapeutiliste rakenduste jaoks. Käesoleva projekti raames saadud tulemused on seega olulised nii kitsamalt neurotrofiinide kogukonnale kui laiemalt neurobioloogidele ja südameveresoonkonna uurijatele; lisaks annavad need andmed ravistrateegiate kavandamiseks ja rakendamiseks vajalikke põhiteadmisi. Selle projekti eesmärkide saavutamiseks oli vaja kasutusele võtta ja optimeerida erinevaid meetodeid erinevate rakutüüpide kasvatamiseks ja biokeemilisteks eksperimentideks. Projekti tulemusena on need nüüd osa rühma mitmekülgsest tööriistakomplektist ja neid saab rakendada mitme meie uurimisküsimuse lahendamiseks, mida ma isiklikult pean projekti oluliseks tulemuseks. Oluline verstapost ja ja selle stipendiumiga seotud üks peamine saavutus on ka kaasjuhendatud üliõpilase magistritöö edukas kaitsmine.

Projekti eesmärgiks on skisofreenia varajase molekulaarse diagnostika arendamine